怎样治白癜风淋病的实验室诊断
淋病的实验室诊断
淋病的实验室诊断
中华医学检验杂志 1998年第3期第21卷 综述
作者：吕绳凯 储迅涛
单位：200052，上海市临床检验中心微生物研究室
淋病是最重要的性传染疾病之一。由于医学、社会和法律上的原因，正确的实验室诊断尤为重要。在男子，淋球菌通常引起带有脓性分泌物和严重排尿困难的急性尿道炎，从感染到发病通常在1～7天间。在妇女，主要感染部位是子宫颈内膜，症状轻微而不易察觉，感染后不加处理，会使感染上行，导致较严重后果，例如终身不孕。潜伏期间毫无症状的带菌者极易感染他人，所以对高危人群的定期筛检很重要。目前淋病的实验室诊断方法有培养法、免疫学方法和分子生物学方法等，培养法仍是现今最可靠的、可作为常规实验的方法，但需要医生和实验室之间密切配合，特别要注意样品的采集、培养基的选择、正确接种和鉴定等步骤。
一、淋球菌的培养检测
1.样品采集：给患者做采样准备时，只能用消*温水或生理盐水，不能用其他消*剂和润滑剂，极其少量的这些物质会影响培养阳性率。藻蛋白钙盐纤维和人造纤维Rayon是合适的拭子材料。棉拭子所含脂肪酸对淋球菌有抑制，如使用，应直接接种在培养基上或在含活性炭的运送管中送实验室。在妇女，应在扩张器帮助下直接从子宫颈内膜采样，平缓地左右移动拭子并停留10～20秒，使细菌充分粘附。在无症状男性，可在排尿至少1小时后从尿道2～3 cm处采样。淋球菌对干燥和温度特别敏感，采样后要立刻种在预温过的培养基上，在任何情况下包括运送过程中均不能放冰箱。
2.培养介质：原来使用巧克力平板，但其他细菌更快的生长妨碍了淋球菌的回收，1966年Thayer和Martin［1］介绍了含多粘菌素B和瑞斯托菌素(Ristocetin)的巧克力琼脂，选择性地回收淋球菌和脑膜炎球菌，称淋球菌选择性(TM)琼脂。目前国内外均推荐使用改良TM(MTM)琼脂，它含万古霉素(3 μg/ml)、粘菌素(7.5 μg/ml)、制霉菌素(12.5 μg/ml)以抑制杂菌，并以三甲氧苄二氨嘧啶抑制游动性变型杆菌［2］。
3.培养：淋球菌在CO2浓度＜3%时可不生长，＞5%时会被抑制生长。烛缸CO2约3%则很适合其生长，但不能采用彩烛。环境应潮湿，烛缸中介质水气的蒸发提供了良好的湿度。无湿度控制的老式CO2孵箱，应在箱底放一水盘。
4.证实鉴定：临床微生物实验室要有能力从推测性鉴定的基础上对从选择性平板上来的奈瑟菌属进行证实鉴定，目前有以下三类方法：(1)改良的碳水化合物利用试验：最近10年，传统试验仅作参照方法使用，实际工作中往往使用1～4小时读结果的改良法，它使用高浓度的菌液和碳水化合物。成功的关键在于使用试剂级的糖和新鲜的18～24小时细菌培养物，麦芽糖的纯度尤为重要，它往往含葡萄糖杂质，足以产生假阳性或可疑结果［3，4］。(2)免疫学方法：荧光标记抗淋球菌抗体的荧光抗体法、抗体致敏的葡萄球菌块凝法或胶乳凝集试验均可用于培养物的证实鉴定，以往用抗淋球菌脂多糖多克隆抗体，新的商品试剂用抗淋球菌外膜蛋白单抗。要注意的是淋球菌外膜蛋白-单抗的靶蛋白能发生变化，假阳性虽然很少，但不是绝对没有［5］。免疫胶乳试验操作简便，数分钟即可判断结果，正确率接近100%，是最受欢迎的证实试验。(3)显色酶基质法：使用特殊的生化试剂检测不同细菌上的酶活力，基质的水解产生有颜色的终点产物，可直接看结果，也可加显色发展试剂。从选择性平板上获得的细菌涂在商品化的纸条上或置于含基质的试管中，10或30分钟按附表判读结果［6］。
附表 淋球菌显色酶基质法证实试验结果判别
显色酶
解乳糖奈瑟菌
脑膜炎奈瑟菌
淋病奈瑟菌
卡他布拉汉菌
β-半乳糖苷酶
+
-
-
-
谷酰基氨肽酶
-
+
-
-
脯氨酰氨肽酶
+
不定
+
-
注：“+”为阳性，“-”为阴性 二、免疫学检验
1.抗原检测：免疫学方法目前尚不能作为常规试验直接检测泌尿道样品中的抗原。在有症状男性的样品中，阳性率在79%～96%之间，但在妇女中要比培养低得多。Abbott实验室的Gonozyme酶免疫淋病诊断试剂盒，直接从泌尿道拭子中检测淋球菌抗原。它使用包被抗淋球菌抗体的聚苯乙烯珠为载体，采样后的拭子浸泡在特定的贮存液中送检，测试前加入稀释剂，5分钟后方可测定，以确保抗原成分充分抽提。此试验对有症状的男性患者有效，培养阳性者中有93.3%呈阳性，无假阳性发现。但检测女性患者宫颈拭子的结果并不理想，虽然专一性达97.0%，但阳性率只有87.0%［7］。Gonozyme也能以尿为样品，代替泌尿道的侵入性拭子取样，在男女患者中与培养法对照，阳性率分别为83.6%和62.5%，专一性分别为89.2%和81.1%，在推荐用于常规筛选法之前尚需改进［8］。
2.抗体检测：在男子，淋病奈瑟菌的感染首先局限于前段尿道，细菌不断地为排尿冲除，刺激机体产生保护性免疫反应所需的抗原量受到了限制，其血清抗体检测的阳性率多数报告中只有50%左右，无实用意义。由于以前感染过淋病的患者血清中往往存在可检出的抗体，再加上与其他奈瑟菌的抗体有可能呈交叉反应等因素，妇女的血清抗体检测阳性率虽然可以较高，但也缺乏诊断价值。
三、DNA杂交和核酸扩增
过去10年中，聚合酶链反应(PCR)技术的进展使实验室能直接从样品中以高敏感度检测淋球菌［9］。PCR技术检测成败的关键在于设计出一对合适的引物，使其在扩增过程中能迅速产生大量靶序列。其他扩增系统，如连接酶链反应(LCR)可用于检测点突变，反应中所用的酶有DNA连接酶、大肠杆菌连接酶与耐热DNA连接酶。Abbott实验室的LCR试剂盒使用4个与淋球菌opa-1基因区(基因库命名NGOOPC B)互补的探针，扩增产物在该公司IMx仪上以微球酶免疫化学方法自动检测。微球以抗半抗原A抗体包被，探针分别以半抗原A和B标记，未连接的B标记探针在洗涤中除去，连接的带有A和B均标记的寡核苷酸链为固相免疫微球捕获，然后与抗半抗原B-碱性磷酸酶缀合物相接，在磷酸盐萤光基质存在下释放萤光分子。萤光激发速率可自动检测，它是扩增产物的检测信号。检测后以金属螯合物和氧化剂自动化学灭活所有与样品接触容器中的DNA，避免污染。淋球菌实验室诊断的*金标准是培养法，考虑到培养法阳性率在85%～90%间，有假阴性可能。所以在评估淋球菌LCR时往往采用延伸的*金标准：凡是培养阴性，LCR复测仍阳性者，送Abbott实验室，以不同的、与原来LCR探针无联系的、针对淋球菌其他专一性靶位(gonococcal pilin B)的探针证实为阳性者，列为真阳性计算。用上述试剂和方法，评估1 538份宫颈拭子样品，LCR敏感度97.3%，专一性99.6%；808份男子尿道拭子样品的敏感度为98.5%，专一性为99.8%；培养法敏感度为83.9%［10］。LCR试验还可用患者自己获得的阴道拭子为样品进行检测，与宫颈内膜样品检测结果比较，二者准确性相仿。采用阴道拭子样品既简便、又可避免交叉感染的危险，对控制淋病很有意义［11］。1995年Smith等［12］对非损伤性尿样品LCR淋球菌检测进行了评估，与培养法相比，符合率超过98%。
同年，Mahony等［13］以多种(M-)PCR同时从大约200个尿标本中检查淋球菌和沙眼衣原体，对淋球菌的检测敏感度为92.3%，专一性为100.0%，而对沙眼衣原体二者均为100.0%。性病患者中，淋病往往伴随其他性传染疾病，以尿为样品的M-PCR有良好的前景。PCR技术在实际工作中一个较难解决的问题是假阳性有可能较高，主要原因是污染，使它至今不能成为一个常规方法。
四、淋病奈瑟菌的药敏试验
1997年，美国国立临床实验室标准化委员会(NCCLS)在纸片药敏试验法规中，推荐直接于16～24小时培养后的平皿中挑取菌落，在肉汤或盐水中制成0.5麦氏单位菌液，接种非选择性淋病奈瑟菌培养基做药敏试验。对供选用的抗生素NCCLS也有规定，除青霉素、大观霉素、四环素和氟嗪酸外，尚有两组头孢类药物可供选择。要注意的是每组中的头孢类药物因其显示的活力谱通常相同，临床功效相当 ，只需在一组中选一个药物做药敏试验即可，不需要重复做药敏试验。
参考文献
1Thayer JD, Martin JE. An improved selective medium for cultivation of Neisseria gonorrhoeae and N. meningitidis. Public Health Rep, 1966,81：559～562.
2Seth A. Use of trimethoprim to prevent overgrowth by proteus in the cultivation of Neisseria gonorrhoeae. Br J Vener Dis, 1970,46：.
3Morello JA, Janda WM, Bohnhoff M. Neisseria and Branhamella. In: Lennette EH, et al. Manual of Clinical Microbiology. 4th ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 1985..
4Janda WM, Ulandy MG, Bohnhoff M, et al. Evaluation of the RIM-N, Gonochek Ⅱ, and Phadebact systems for the identification of pathogenic Neisseria SPP. and Branhamella Catarrhalis. J Clin Microbiol, 1985,21：.
5Kellogg JA, Orwig LK. Comparison of gonogen, Gonogen Ⅱ, and microtrack direct fluorescent-antibody test with carbohydrate fermentation for confirmation of culture isolates of Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol, 1995,33：.
6Sperry JF, Cohenford MA, Campognone P, et al. Increased detection of prolylaminopeptidase in Neisseria meningitidis by identicult-Neisseria. J Clin Microbiol, 1986,24：145.
7Schachter J, McCormack WM, Smith DF, et al. Enzyme immunoassay for diagnosis of gonorrhea. J Clin Microbiol, 1984,19：.
8Wong KC, Ho BSW, Egglestone SI, et al. Diagnosis of urogenital gonorrhoea: evaluation of an enzyme immunoassay and use of urine as a non-inavsive sopecimen. Br J Biomed Sci, 1994,51：.
9叶元康，陆震宇，吴茵茹，等.PCR测定淋病奈瑟菌的实验室研究和临床应用.中华微生物学和免疫学杂志，1996，16(增刊2)：.
10Shanfun Ching, Helen Lee, Edward WHⅢ, et al. Ligase chain reaction for detection of Neisseria gonorrhoeae in urogenital swabs. J Clin Microbiol, 1995,33：.
11Edward WHⅢ, Shanfun Ching, Stephens J, et al. Diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infection in women by using the ligase chain reaction on patient-obtained vaginal swabs. J Clin Microbiol, 1997,35：.
12Smith KR, Shanfun Ching, Helen Lee, et al. Evaluation of ligase chain reaction for use with urine for identification of Neisseria gonorrhoeae in females attending a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol, 1995,33：.
13Mahony JB, Luinstra KE, Tyndall M, et al. Multiplex PCR for detection of chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J Clin Microbiol, 1995,33：.
(收稿： 修回：)
